蛋白質(zhì)是一切活細(xì)胞和有機(jī)體的最重要和最必需的組成成分，它是構(gòu)成人體及所有動(dòng)物機(jī)體組織干物質(zhì)的主要部分。例如，人體按總量計(jì)算，干重54％是蛋白質(zhì)，即除去水分后，蛋白質(zhì)約占體重的一半左右，可見蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)中最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

       蛋白質(zhì)是由二十種氨基酸以肽鍵相互聯(lián)接而成的復(fù)雜的高分子化合物，它水解的最終產(chǎn)物是氨基酸。在蛋白質(zhì)分子內(nèi)又通過氫鍵、鹽鍵、疏水作用力構(gòu)成蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，即蛋白質(zhì)的構(gòu)象（ conformation )。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子受到某些物理、化學(xué)因素影響時(shí)，它的空間結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)生改變或破壞，物理化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)也隨著發(fā)生變化，稱為蛋白質(zhì)的變性作用。因此在研究蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能時(shí)，應(yīng)防止它的變性作用。

       蛋白質(zhì)在溶液中的分子大小，溶解度，電荷，吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等各不相同，根據(jù)這些因素，可以選擇一定的方法分離，制備和鑒定蛋白質(zhì)。利用蛋白質(zhì)肽鏈末端基的特點(diǎn)，還可以設(shè)計(jì)特殊的分析技術(shù)來測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。

       氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，它也是生物體維持生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有特殊的生理作用，參與生物機(jī)體的代謝。因此對(duì)氨基酸的分離測(cè)定在實(shí)際工作中也是重要的。

       蛋白質(zhì)含量可從它們的物理化學(xué)性質(zhì)，如折射率、比重，紫外吸收、染色等測(cè)定而得知；或用化學(xué)方法，如定氮、雙縮脲反應(yīng)、 folin﹣酚試劑反應(yīng)、BCA法等方法來測(cè)定。其中 Folin ﹣酚試劑法和考馬斯亮藍(lán)染色法是一般實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)常使用的方法。而 Folin﹣酚試劑法靈敏度較高，較紫外吸收法靈敏10~20倍，而較雙縮脲法靈敏100倍左右。這類方法操作簡(jiǎn)便、迅速，不需要復(fù)雜和昂貴的設(shè)備，又能適合一般實(shí)驗(yàn)室的要求，若作一般測(cè)定較為適宜。

       一、雙縮脲法

       1.原理

        在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，而與蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍1~10mg蛋白質(zhì)。

        雙縮脲法常用于需要快速但并不需要十分精確的測(cè)定。硫酸銨不干擾此呈色反應(yīng)，使其有利于對(duì)蛋白質(zhì)純化早期步驟的測(cè)定。

        干擾此測(cè)定的物質(zhì)包括在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖劑，例如 Tris 緩沖液，因?yàn)樗鼈兘o予陽性呈色反應(yīng)。Cu2+也容易被還原，有時(shí)發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)紅色沉淀。

       2.試劑和器材

         ①試劑

    標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液（10mg/mL)：酪蛋自要預(yù)先用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。用0.05mol/L 氫氧化鈉溶液配制。亦可用10mg/ mL 牛血清清蛋白溶液。

       雙縮脲試劑：取1.50g硫酸銅（CuSO4•5H2O）和6.0g酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O )，用500mL水溶解，在攪拌下加入300mL10％氫氧化鈉溶液，用水稀釋到1000mL，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長(zhǎng)期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需重新配制。

       ②器材

         分光光度計(jì)，恒溫水浴

       3．操作方法

        標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：取12只試管分成兩組，分別加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL的標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液，用水補(bǔ)足到1mL，然后各加入4mL雙縮脲試劑，充分搖勻后，在室溫下（20~25℃）放置30分鐘，于540nm處進(jìn)行比色測(cè)定。取兩組測(cè)定的平均值，以酪蛋白的含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為定量的依據(jù)。

        用同樣的方法測(cè)定未知樣品，注意樣品濃度每ml不要超過10mg，否則要適當(dāng)稀釋。

       二、Folin﹣酚試劑法（Lowry法）

         1.原理

         用于蛋白質(zhì)測(cè)定的 Lowry 反應(yīng)是雙縮脲方法的發(fā)展，第一步涉及到在堿性溶液中銅﹣蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成，然后這個(gè)復(fù)合物還原磷鉬酸﹣磷鎢酸試劑（Folin氏試劑），產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物）。這個(gè)測(cè)定法較雙縮脲法靈敏得多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子同樣容易干擾Lowry反應(yīng)，而且對(duì)后者的影響還要大得多。所測(cè)蛋白質(zhì)樣品中若含酚類及檸檬酸均有干擾作用。濃度較低的尿素（約0.5％左右）、胍（0.5％左右）、硫酸鈉（1%)、硝酸鈉(1%)、三氯乙SUAN（0.5%)、乙醇（5%)、乙MI（5%)、丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無影響，這些物質(zhì)濃度高時(shí)必須做校正曲線。含硫酸銨的溶液只須加濃碳酸鈉﹣氫氧化鈉溶液即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，顯色后色淺，則必須提高碳酸鈉﹣氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。

         進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加 Folin 氏試劑要特別小心，因?yàn)?Folin 氏試劑僅在酸性pH 條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只是在pH10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin氏試劑加到堿性的銅﹣蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸﹣磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。

此法也適用于酪氨SUAN和色氨SUAN的定量測(cè)定。

       2.操作方法

    2.1樣品測(cè)定

           取1ml樣品溶液（約含20-250ug多肽或蛋白質(zhì)），加入5ml試劑甲，混勻，于20~25℃保溫30分鐘，然后于500nm處比色。以1ml水樣替代品作為空白對(duì)照。

       2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

           取14只試管分成兩組，分別加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（250ug/ml），用水補(bǔ)足到1mL，然后按上述方法進(jìn)行操作，測(cè)定光吸收值。取兩組測(cè)定的平均值，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線作為定量的依據(jù)。

          若用0.5cm光程的比色池進(jìn)行比色，可按下面方法進(jìn)行操作：取0.2ml樣品溶液（約含5~100ug多肽或蛋白質(zhì)），加入1ml試劑甲（可選用0.3cm~0.5cm直徑的小試管），混勻，10分鐘后再加0.1ml試劑乙，立即搖勻，30分鐘后比色。若多肽或蛋白質(zhì)濃度在5~25ug，則波長(zhǎng)用755nm，25ug以上則采用500nm比色為宜。

       3.試劑和器材

          3.1試劑

1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：可用結(jié)晶牛血清清蛋白或酪蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度配制成250ug/ml的溶液。

2. Folin-酚試劑的配制（均用分析純?cè)噭?/span>

    試劑甲：由下述4種溶液配制的。（1）4％碳酸鈉（ Na2CO3）溶液；（2）0.2mol/L 氫氧化鈉溶液；（3）1％硫酸銅（ CuSO4•5H2O ）溶液；（4）2％酒石酸鉀鈉溶液（或酒石酸鉀、酒石酸鈉）。在使用前，將（1）與（2）等體積混合配成碳酸鈉﹣氫氧化鈉溶液，將（3）與（4）等體積混合配成硫酸銅﹣酒石酸鉀鈉溶液。然后將這兩種溶液按50:1的比例混合，即為 Folin﹣酚試劑甲。該試劑只能用一天，過期失效。

          試劑乙（ Folin 氏試劑）：市售福林酚試劑

       3.2器材

          分光光度計(jì)    恒溫水浴

       三、考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford法）

         1.原理

          1976年 Bradford 建立了用考馬斯亮藍(lán) G -250與蛋白質(zhì)結(jié)合的原理，迅速、敏感的定量測(cè)定蛋白質(zhì)的方法。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起染料最大吸收的改變，從465nm變?yōu)?95nm，光吸收增加。蛋白質(zhì)﹣染料復(fù)合物具有高的消光系數(shù)，因此大大提高了蛋白質(zhì)測(cè)定的靈敏度，檢出量為1ug蛋白。染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合是很迅速的過程，大約只需2分鐘，結(jié)合物的顏色在1小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。一些陽離子，如 K+ , Na+, Mg2+ ,( NH4)2SO4，乙醇等物質(zhì)不干擾測(cè)定，而大量的去污劑如 TritonX -100, SDS 等嚴(yán)重干擾測(cè)定，少量的去污劑可通過用適當(dāng)?shù)膶?duì)照而消除。以下試劑對(duì)考馬斯亮藍(lán) G -250-蛋白質(zhì)復(fù)合物有影響：1mol/LKCL、5mol/NaCL、1mol/LMgCL2、2mol/LTris、0.1mol/LEDTA、1mol/L(NH4)2SO4、99%乙醇、5%酚、丙酮、0.1%TritonX-100、1%TritonX-100、0.1%SDS、1%SDS。由于染色法簡(jiǎn)單迅速，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

       2.操作方法

    2.1標(biāo)準(zhǔn)方法

     取含10~100ug蛋白質(zhì)溶液于小試管中，用雙蒸水或緩沖液調(diào)體積到0.1mL ，然后加入5mL蛋白試劑，充分振蕩混合，2分鐘后于595nm測(cè)定光吸收值。以0.1mL 雙蒸水或緩沖液及5mL 蛋白試劑作為空白對(duì)照。

       2.2微量蛋白分析法

     取含1~10ug蛋白質(zhì)溶液，用雙蒸水調(diào)體積到0.8mL，加0.2mL蛋白試劑，充分振蕩混合，2分鐘后于595nm測(cè)定光吸收值，以0.8mL雙蒸水及0.2mL蛋白試劑作為空白對(duì)照。

     用不同濃度的蛋白質(zhì)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線作為定量的依據(jù)。

       3.試劑和器材

    試劑

1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：可用牛血清清蛋白預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度配制成1mg/ mL 的溶液。或根據(jù)牛血清清蛋白的紫外消光系數(shù) A1% 1cm＝6.6來確定。

2. 蛋白試劑的配制：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%（W/V）磷酸，將溶液用水稀釋到1000ml。試劑的終濃度為0101%考馬斯亮藍(lán)G-250，4.7%（W/V）乙醇，和8.5%（W/V）磷酸。

   器材

         分光光度計(jì)     微量注射器

       四、BCA法

          1.產(chǎn)品描述

             BCA（Bicinchonininc Acid）蛋白含量檢測(cè)法是用于總蛋白質(zhì)定量的常用方法，BCA 與二價(jià)銅離 子混合即為 BCA 工作液，蛋白在堿性條件下能夠?qū)?Cu2+還原為 Cu+，Cu+與 BCA 試劑可形成紫色絡(luò) 合物，產(chǎn)物在 562 nm 處具有特征吸收峰，通過吸光值變化即可定量檢測(cè)樣品的蛋白濃度。

          2.注意事項(xiàng)

            ①Copper Solution 與 PBS Diluent 可置于 2-8℃長(zhǎng)期保存，若發(fā)現(xiàn)污染渾濁則應(yīng)丟棄；BCA Solution 在低溫條件下出現(xiàn)結(jié)晶沉淀時(shí)，可 37℃溫育使其*溶解，不影響使用；

            ②為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作；

            ③BCA 法測(cè)定蛋白含量不受絕大部分樣品中化學(xué)物質(zhì)的影響，樣品中 5% SDS、5% Triton X-100、 5% Tween20、60、80 等常用濃度去垢劑不影響檢測(cè)結(jié)果，但 EDTA 和 EGTA 等螯合劑、DTT 和巰基 乙醇等還原劑和脂類會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，需確保 EDTA 低于 10 mM、無 EGTA、二硫蘇糖醇低于 1 mM、 巰基乙醇低于 0.01%；若樣品含有較多干擾物質(zhì)且本身背景值較高，建議使用 Bradford 法蛋白含量檢測(cè)試劑盒（Cat AKPR015）；

            ④若蛋白濃度較低時(shí)（小于 50 μg/mL），可將顯色溫度提高至 60℃且待測(cè)樣本

與工作液比例調(diào)整 為 1:8 進(jìn)行測(cè)定，能夠明顯提高靈敏度至 5 μg/mL；

            ⑤為保證結(jié)果準(zhǔn)確且避免試劑損失，測(cè)定前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書（以實(shí)際收到說明書內(nèi)容為準(zhǔn)）， 確認(rèn)試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備是否充分，操作步驟是否清楚，且務(wù)必取 2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)定，過程中問題請(qǐng)您及時(shí)與工作人員聯(lián)系。